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大家好！今天為大家介紹本課題組2020 年發表在Small上的文章，題目為 “Highly Sensitive Minimal Residual Disease Detection by Biomimetic Multivalent Aptamer Nanoclimber Functionalized Microfluidic Chip”。本工作受自然界中攀援植物的啟發，構建了一種具有柔性骨架的多價核酸適體聚合物，結合“增頻碰撞”的微流控芯片，提出了一種入侵性低、靈敏度高、臨床適用性強的微小殘留病檢測新方法。論文的第一作者是本課題組三年級博士生劉藝龍同學（課題組網頁：http://www.yang-lab.com/）。

【背景】
        微小殘留病（Minimal residual disease, MRD）是指治療過程中或完全緩解后存在于白血病患者體內的少數白血病細胞，是白血病復發的主要原因。精準的MRD檢測結果可用于評估患者對初始治療的反應，進而按照危險度進行分層治療，還可用于評估造血干細胞移植后的疾病負荷變化以及預測白血病早期復發等。然而，傳統的MRD檢測技術面臨靈敏度較低或者臨床適用性較差的問題。例如，對于急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）來說，基于流式細胞術的免疫表型分析臨床適用性好（適用于超過90%的患者），但其靈敏度僅為~10^-4（在10⁴個背景細胞中檢測出1個白血病細胞），因此需要高入侵性的骨髓穿刺進行取樣；相反，基于RT-qPCR的遺傳學檢測的靈敏度高至10^-6，但其僅適用于不到20%的表達常見融合基因的T-ALL患者。因此，發展一種入侵性低，靈敏度高，臨床適用性強的MRD檢測新技術具有重要臨床意義。 

        微流控技術具有容易集成，高通量和高靈敏度等優勢，特別適用于外周血中微小殘留病細胞的富集和檢測。其中，相比于物理分離方法，結合特異性識別分子的親和捕獲方法具有靶細胞捕獲率和純度高的優點。核酸適體被譽為“化學抗體”，在癌細胞識別與捕獲方面具有許多優于抗體的特點，例如價格低廉、批次間差異小、容易修飾和組裝等，最重要的是能夠通過互補DNA置換或者核酸酶降解等方法實現癌細胞的無損釋放，為癌細胞的下游分析提供前提。但是，核酸適體的空間結構易受復雜環境的影響，從而影響其親和力，阻礙其臨床應用。因此，設計高穩定性和高親和力的核酸適體探針是解決上述難點的關鍵。

【設計思路】

自然界中的攀援植物具有靈活的骨架，能夠幫助它們適應不同的地勢，而骨架上眾多的吸盤或卷須結構，能幫助它們牢牢地攀附在支撐物上面。受此啟發，作者通過簡單的自由基聚合反應合成了具有柔性骨架的多價核酸適體聚合物（MANC），長而靈活的骨架可適應細胞的表面拓撲學結構，且骨架上的眾多核酸適體能與白血病細胞上的多個受體結合，這種協同的“多價識別”效應能夠顯著提升核酸適體對靶細胞的親和力。同時，作者利用了課題組前期為了提高循環腫瘤細胞的捕獲效率而設計的具有“增頻碰撞”作用的微流控芯片，進一步增加白血病細胞與MANC的碰撞頻率。該芯片內按照確定性側向位移原理排布了上萬個旋轉的三角形微柱，血樣流過芯片時，尺寸較大的白血病細胞能夠發生側向偏移，反復與微柱上的MANC碰撞，從而提高捕獲率；而尺寸較小的血細胞則沿著原本的流線向前運動，與微柱碰撞表面的MANC碰撞概率低，從而減小背景細胞的非特異性吸附。最后，作者選用核酸酶處理以選擇性地釋放被捕獲的白血病細胞，為白血病細胞下游分析提供了前提（圖1）。

圖1 （A）仿生多價核酸適體聚合物的合成；（B）協同尺寸分離和多價識別的白血病細胞親合捕獲及選擇性釋放的微流控平臺
【數據介紹】作者在系統地優化完聚合反應條件后，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗證明了該反應具有很高的重現性；通過假設1）所有反應單體的反應活性相等；2）聚合物和DNA marker具有相同的電泳遷移率，得出聚合物上的平均核酸適體數量為~30條（圖2A）。同時，考察了40%（v/v）人血清條件下單價核酸適體和多價核酸適體聚合物與靶標細胞的平衡解離常數。如圖2B-C所示，單價核酸適體的Kd值為59 ± 9 nM，而多價核酸適體的Kd值下降至1.03± 0.14 nM，仍具有非常高的親和力。

圖2 多價核酸適體聚合物的表征。（A）聚合產物分子量及聚合反應重現性表征；（B-C）單價核酸適體（C）和多價核酸適體（D）對靶細胞的平衡解離常數表征

        通過生物素和鏈霉親和素之間的強相互作用，制備了多價核酸適體聚合物功能化的微流控芯片（MANC-Chip）。為了證明MANC-Chip提高了細胞捕獲性能，作者對比了全血條件下MANC-Chip、單價核酸適體修飾功能化的芯片（Sgc8-Chip）、嫁接隨機DNA序列的聚丙烯酰胺功能化的芯片（nMANC-Chip）的白血病細胞回收率（圖3A）。通過回歸方程的斜率計算捕獲效率，MANC-Chip的白血病細胞捕獲率高達92.2%，相比Sgc8-Chip提高了2.45倍，而非特異吸附率僅為0.11%（圖3B）。作者接著考察了芯片的細胞釋放性能。如圖3C-D所示，88.9%的靶標細胞在核酸酶處理后能被選擇性的釋放，而吸附的正常白細胞幾乎不會從芯片上脫落，這進一步提高了靶細胞的純度，且核酸酶釋放后，細胞活性仍有93.8%，為進一步的培養和分析提供了前提（圖3E-F）。

圖3 芯片的細胞捕獲和釋放性能表征。（A）回收率；（B）捕獲率；（C）核酸酶介導的白血病細胞釋放；（D）MANC-Chip的細胞釋放率；（E-F）細胞釋放后的活性表征

最后，作者將MANC-Chip應用于捕獲臨床T-ALL患者外周血樣本中的殘留白血病細胞，如圖4A所示，同時表達T細胞抗原（CD3）和酪氨酸激酶7（PTK7）的細胞被認定為殘留T淋巴白血病細胞，而CD3陽性且PTK7陰性的細胞為正常T淋巴細胞。如圖4B所示，治愈的白血病患者（CR）外周血中的殘留白血病細胞數量恢復到健康對照組（HD）的濃度水平；而部分緩解的患者外周血中的殘留白血病細胞數量顯著高于健康對照組（p = 0.0097）。說明MANC-Chip可用于區分部分緩解和完全治愈的T-ALL患者。值得一提的是，作者在一例流式檢測陰性的患者中檢測到30個殘留白血病細胞，隨后臨床表現證實該患者疾病復發，患有中樞神經系統白血病。說明MANC-Chip能在疾病復發的早期檢測到異常數量的白血病細胞。

圖4 MANC-Chip在臨床樣本中的應用。（A）免疫熒光分析；（B）臨床樣本中殘留白血病細胞數量統計圖
【總結】
        本工作合成了一種仿生的多價核酸適體聚合物，顯著提高了核酸適體在復雜體系中的親和力。結合“增頻碰撞”微流控芯片，進一步發展了一種低入侵性（外周血取樣），高靈敏度（可達10^-6），高臨床適用性（10/10）的微小殘留病檢測新方法。由于其高效的細胞捕獲性能，MANC-Chip為白血病治療效果評估，復發監測等提供了一種無創性的替代檢測方法。此外，高效溫和的靶標細胞釋放性能為白血病細胞下游分析提供可能性，從而幫助我們更好地研究白血病的復發機制等。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smll.202000949