引語

化學發光(CL)是在沒有光源和光譜系統的情況下，化學反應產生的光發射，其在信噪比、靈敏度和線性范圍方面有很大的優勢。化學發光(CL)生物檢測已成為臨床診斷的主要技術之一。一般來說，單一的標志物的檢測對于疾病的準確診斷是不夠的。因此，多種生物標志物的測定越來越受到人們的關注。如何在單個芯片上實現對多個標記物的同時檢測和快速準確診斷仍是一個巨大的挑戰。

 本研究首次報道了獨特的時空彩色多分辨化學發光成像系統并用于多重免疫測定。該創新策略具有靈敏度高、選擇性強、操作簡單、成本低等優點，避免了復雜的標記過程和來自相鄰檢測區的干擾，這項工作為多路分析的時間-空間-彩色多分辨成像打開了一扇門。

如示意圖所示，在雙層紙基微流控襯墊的頂層有注射區，在毛細管力的驅動下，可通過親水微通道自動、有序地輸送反應試劑到三個檢測區域。自動觸發CL和共振能量轉移(CRET)反應，并由智能手機攝像頭記錄時間-空間-彩色多分辨CL成像信號。

成果簡介

1. 時間-空間-彩色多分辨CL成像系統介紹。

如附件視頻S1所示，1號檢測區域信號為黃綠色發光，在20秒左右開啟，在32秒關閉。2號檢測區域為藍色發光，在35秒左右開啟，在48秒左右關閉。3號檢測區為藍綠色發光，在55秒左右開啟，在90秒左右關閉。由此得到了時空彩色多分辨閃爍型CL成像信號。由于相鄰探測區的光發射間隔時間較長(大于2 s)，采用時空分辨CL成像策略，相鄰光發射之間完全不存在干擾。魯米諾-雙氧水-ZIF-67體系的發光光譜在440 nm處表現出最大的發光波長(圖S2)，與熒光素和吖啶黃的激發波長匹配良好，為實現CRET反應提供了一個平臺。魯米諾-雙氧水-ZIF-67-熒光CRET體系的發光光譜在530 nm處表現出最大的發射波長(圖S2)，證明從LO₂^2-*到熒光素(F^2?*)的有效能量轉移，對應于1號檢測區發射黃綠色光。魯米諾-雙氧水-ZIF-67-吖啶黃CRET體系的發光光譜在500 nm處表現出最大發射波長(圖S2)。驗證了從LO₂^2-*到吖啶黃的有效能量轉移，形成3號檢測區藍綠色發光。

2.沸石咪唑酯骨架結構材料ZIF-67用于檢測系統。

在沒有沸石咪唑酯骨架結構材料ZIF-67的情況下，使用智能手機時，光的發射相當微弱，無法檢測到。利用ZIF-67作為催化劑，提高了魯米諾體系的電化學發光性能。在這個研究發現，ZIF-67還可以增強魯米諾-雙氧水反應的CL。TEM圖像和XRD結果(圖S3A,B)表明，ZIF-67顆粒為十二面體晶體結構，邊長約200 nm。 ZIF-67的EDS結果(圖S3C)表明，ZIF-67的主要元素為C、N、Co，電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測定的ZIF-67的Co含量為9.73%。ZIF-67納米結構中原子分散的陽離子可以促進雙氧水的分解，生成高活性的羥基自由基(OH*)。OH*與魯米諾反應生成魯米諾自由基。然后與O₂反應生成O₂*^-。最后，O₂*^-與魯米諾自由基反應產生強CL發射。魯米諾-雙氧水-ZIF-67體系CL反應的強度分別比魯米諾-雙氧水和魯米諾-雙氧水-Co(Ⅱ) 增強了50倍和3倍(圖S3D)。ZIF-67催化多色光發射的機理如圖S4所示。

3.時空彩色多分辨CL成像系統視頻檢測模式驗證。

不同濃度CEA、AFP、PSA存在時三個檢測區域的疊加圖如圖2A-C所示。可見，在CEA、AFP、PSA檢測區疊加的圖片中，分別記錄了1個黃綠色、1個藍色、1個藍綠色圓形光點。三個光斑的CL強度分別隨著CEA、AFP、PSA濃度的增加而逐漸降低。此外，如果用Co(Ⅱ)離子取代ZIF-67，光發射與相應抗原的濃度關系不大。因此，ZIF-67是制造該免疫分析系統的關鍵。

以ZIF-67為主的CL免疫分析的可能機制如圖S5所示。在傳感界面上特異性免疫反應形成的大免疫復合物阻礙了ZIF-67顆粒向紙基的運輸，并在紙基ZIF-67催化劑和CL試劑之間形成蛋白型障礙，同時該免疫復合物可以阻斷自由基在CL和CRET反應中的電子轉移，抑制了ZIF-67的催化作用，導致抗原依賴模式下的光發射明顯減少。通過計算每個光斑的灰度值，實現了CEA、AFP、PSA的定量。如圖2D-F所示，得到了三條線性校準曲線。CEA的檢測回歸方程為ΔGray = 2.07 l0g C + 29.92, R² = 0.9973,檢測范圍為1 pg/mL ~ 10 ug/mL。AFP的ΔGray = 4.19 logC+ 51.56, R²0.9970，檢測范圍從10 pg/mL到0.2 ug/mL。PSA的ΔGray = 8.32 log C + 122.30, R²= 0.9985，檢測范圍為10 fg/mL到50 ng/mL。ΔGray通過空白灰度值與相應抗原灰度值相減獲得，C為濃度(g/mL)。CEA、AFP 和 PSA的檢出限為0.2 pg/mL，3.2 pg/mL和 4.2 fg/mL.

4. 時空彩色多分辨CL成像系統照相檢測模式驗證。

在2分鐘的曝光時間下在一張照片中記錄三個圓形且均勻的光斑，這些光斑與反應相對應(圖3)。不同濃度CEA、AFP、PSA的圖像如圖3A所示。空白緩沖液存在時，三個光點非常強，但隨著CEA(綠黃色光斑)、AFP(藍色光斑)和PSA(海藍寶石色光斑)濃度的增加，三個光點的強度逐漸減弱。如圖3B所示，得到了三條線性校準曲線。CEA的ΔGray = 6.78 log C+81.54, R² = 0.9962,檢測范圍為5 pg/mL ~ 1 ug/mL。AFP的ΔGray = 9.63 log C+ 121.62, R²= 0.9899, 檢測范圍為1 pg/mL ~ 100 ug/mL。PSA的ΔGray = 22.73 logC + 262.21, R²= 0.9969, 檢測范圍為5 pg/mL ~ 0.2 ug/mL。測定CEA、AFP、PSA的檢出限分別為2.1 pg/mL、0.4 pg/mL、3.9 pg/mL。在CEA、AFP和PSA檢測中，檢測范圍和檢測限優于先前報道的CL μpad(表S1)。這種良好的敏感性主要歸功于ZIF-67對CL和CRET反應的巨大催化作用，以及本文提出的抗信號干擾策略。雖然照片檢測模式和視頻檢測模式有相似的成像性能和線性檢測范圍，但是照片檢測模式的發光強度的變化梯度與抗原濃度的變化(表示靈敏度)高于視頻檢測模式。而且照片檢測模式更簡單、方便，對數據存儲和數據處理的要求更少。因此，對于時空彩色多分辨CL成像檢測來說，照片檢測模式是最佳的檢測模式。在智能手機上進一步開發了自編譯應用程序(APP)以便用于智能檢測。

5. 照相檢測模式免疫試劑的選擇性研究。

采用免疫球蛋白G (IgG)、人白蛋白、人纖維蛋白、肽素、心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、心肌鈣蛋白I (cTnI)等多種蛋白作為可能的干擾物。如圖3C所示，從檢測區域相應抗原得到的ΔGray值與含有相應抗原的混合物得到的ΔGray值具有可比性，而從非特異性抗原得到的ΔGray值信號非常微弱。結果表明，所建立的免疫分析方法具有較好的選擇性。相對標準差(RSD)為3.26% ~ 6.57%(表S2)。結果表明，該系統具有較高的檢測精度。通過測定人血清中的CEA、AFP和PSA，進一步研究了所提出的免疫測定方法的實用性。得到滿意的回收率(92-108%)(表S3)。并對所制備的襯墊的貯存穩定性進行了研究。在4℃密封超過30天后，沒有觀察到明顯的信號變化，這表明儲存穩定性是可以接受的。因此，所開發的CL免疫測定法適用于臨床診斷。

圖文導讀

圖1 檢測視頻不同時間典型截圖的疊加圖像，圖像分別對應檢測區域1(A)、2(B)、3(C)產生的光發射

圖2 檢測區1(A)、2(B)和3(C)號在不同濃度的CEA、AFP和PSA存在時的堆疊圖片。CEA (D)、AFP (E)、PSA(F)為視頻檢測模式的代表性校準曲線

圖3 (A)檢測不同濃度CEA、AFP和PSA時的照片。(B)采用照片檢測模式進行CEA、AFP和PSA檢測的典型校準曲線。(C) CL免疫測定的干擾研究，分別設置十個干擾組。

小結

首次利用雙層紙基微流控與智能手機結合，開發了用于多重免疫測定的時間-空間-彩色多分辨化學發光成像免疫分析檢測系統。雙層紙基微流控包括運輸核心反應物的底層和發生免疫反應、CL反應和CRET反應的檢測區域的頂層。在不同檢測區的魯米諾、魯米諾-熒光素、魯米諾-吖啶黃結合特異性抗體進行固定。加入抗原和ZIF-67后，雙氧水被依次運送到不同的檢測區域。然后，利用智能手機作為便攜、方便的檢測設備，觸發ZIF-67催化魯米諾-雙氧水CL和CRET反應，產生時空彩色多分辨CL成像信號。同時，開發了一款在智能手機上運行并用于智能檢測的應用程序。CL成像檢測可采用視頻檢測模式或照片檢測模式進行。作為概念驗證，開發免標記的CL免疫測定法用于測定三種癌癥模型生物標志物，包括CEA、AFP和PSA。時空彩色零分辨CL成像策略具有靈敏度高、選擇性好、簡單、低成本等特點，可以避免復雜的標記程序和鄰近檢測區的干擾，可用于開發各種免疫分析方法，在臨床診斷、食品安全評價、環境監測等領域具有巨大的應用潛力。

原文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c01405

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