蛋白磷酸化是細胞信號轉導的初級載體之一，也是癌癥研究和藥物研發的一個主要研究領域。激酶是一種催化蛋白磷酸化的酶類，激酶抑制類藥物是癌癥靶向治療的主要類型之一，一系列研究小組都在探索利用磷酸化蛋白質組學分析來幫助選擇合適的治療方法，以及追蹤患者對于治療的應答反應。

例如，美國安德森腫瘤中心的研究人員Gordon Mills使用反向蛋白芯片分析了上千名患者的癌癥信號通路，希望鑒定出患者的亞型和治療方法。喬治梅森大學應用蛋白質組學和分子醫學中心Emanuel Petricoin同樣也采用了RPPA法分析腫瘤信號，并指導患者治療。最初由乳腺癌慈善團體Side-Out Foundation發現的結果表明，使用磷酸化蛋白質組學數據指導患者治療可以延長轉移性乳腺癌患者的無進展生存期。

隨著質譜檢測靈敏度的不斷提高，這些方法可以用于腫瘤信號分析。紀念斯隆凱特靈癌癥中心的研究人員近期發表了一種質譜方法，他們計劃在接下來的臨床試驗中使用該方法檢測癌癥信號活性，最終指導癌癥治療。

然而，這些工作都只關注于腫瘤組織的分析。這就給我們帶來了一些挑戰，因為有些患者的腫瘤組織無法獲取并用于活檢，即使有些情況下能夠進行取樣活檢，這種取樣也無法頻繁進行。

在基因組學中，這些限制因素促使研究人員和公司開始尋找液體活檢方法，其中包括分析由腫瘤流入血液中的ctDNA。但采取相同的方法進行血液磷酸化蛋白質組學分析并不容易實現，因為血液中這類分子的濃度非常低，而且血液中的磷酸化蛋白質通常會在循環磷酸酶作用下快速去磷酸化。

大部分磷酸化蛋白并不會第一時間進入血液中。即使磷酸化蛋白由腫瘤釋放，它們也會立即去磷酸化，因為磷酸酶非常活躍而且含量豐富。人們之前嘗試利用血液和尿液樣本進行磷酸化蛋白質組學分析，但這些分析出現的時間很短。

為了擺脫這種限制，Tymora Analytical Operations公司總裁及CTO Anton Iliuk和同事們在循環細胞外膜泡（EVs）中分析這種磷酸化蛋白質，例如微泡和外泌體，這兩者都含有來自起源細胞的遺傳物質和蛋白質。目前，很多研究人員都在嘗試將外泌體作為潛在的臨床樣本，如診斷公司Exosome Diagnostics和NX Prenatal則對外泌體相結合的RNA和蛋白質進行測定，對前列腺炎和早產等情況進行檢測評估。

Iliuk團隊今年年初在PNAS上發表文章，他們在30個乳腺癌患者和6名健康對照個體中進行血漿細胞外膜泡檢測，結果鑒定出144個蛋白質在癌癥患者體內會出現高度磷酸化。研究人員利用Thermo Fisher Q Exactive HF儀器對其中四種蛋白質進行靶向質譜分析，發現其中三個蛋白質（RALGAPA2、PKG1、TJP2）在乳腺癌患者中的磷酸化水平更高。

來源：Tymora公司官網

研究中引用Tymora公司發明的磷酸化蛋白富集方法——PolyMAC，利用攜帶金屬離子的可溶性納米高分子在復雜的復合物中捕獲磷酸蛋白。另一方面，研究人員是使用超速離心法收集細胞外膜泡，然而這種方法不易重復，而且細胞外膜泡復原率很低。因此，團隊開發了一種基于微流體的方法，通過使用一種微流體墨盒來捕獲細胞外膜泡。在使用少量電壓進行靶分子的原位提取后就進行捕獲，這種方法讓研究人員能夠獲得體內的磷酸化蛋白，且在這個過程中不會使其降解，進一步優化了靶向細胞外膜泡捕獲方法和體內磷酸化蛋白質提取方法。

近日，普渡大學和Tymora Analytical Operations公司的研究人員開發了一種用于血液或尿液磷酸化蛋白質組學分析方法，將微流控型微泡和外泌體捕獲法與Tymora的磷蛋白富集試劑相結合，通過血液或尿液樣本分析腫瘤信號通路，這與利用ctDNA分析進行液態活檢的方法類似。他們希望利用該方法檢測并處理各種不同的癌癥。

雖然這項工作仍然處于早期階段，Iliuk期望將這種方法作為循環腫瘤細胞和ctDNA分析之外的另一種液態活檢方法。采用這種方法不需要采集活體組織或有腫瘤出現就可以進行液體活檢，能夠持續性監控疾病，而不是等到有可獲取的活體組織時才開始檢測。

目前，Tymora公司正在尋求腫瘤研究領域的商業合作伙伴，希望進一步探索某些癌癥的研究方法。該公司同時還在開展一項內部項目，利用尿液中細胞外膜泡的磷酸化蛋白組學分析監控膀胱癌術后復發率。研究人員已經在膀胱癌患者和健康人群間發現了大量磷酸化差異，因此，他們正在嘗試開發檢測試劑盒進入診斷領域。

此外，Tymora公司還致力于將其微流體式細胞外膜泡捕獲和提取平臺商業化，作為其他研究人員研究細胞外膜泡時的一個工具。