1.3細(xì)胞培養(yǎng)裝置及細(xì)胞培養(yǎng)

將加工完成的芯片與溫度控制系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)等整合成一個(gè)完整的細(xì)胞培養(yǎng)微系統(tǒng)，并在此微系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)PIEC。通過(guò)微量注射泵供給培養(yǎng)液,通過(guò)熒光顯微鏡完成信號(hào)檢測(cè)。

2.1.1  ITO玻璃的腐蝕 在傳統(tǒng)的玻璃微流控芯片制作工藝中，通常采用石英玻璃作為基質(zhì)材料,但其價(jià)格較為昂貴,制作工藝復(fù)雜，且刻蝕速率較慢，需要長(zhǎng)時(shí)間的刻蝕才能獲得足夠的深度。為此,通常需要在玻璃表面沉積一層薄膜材料作為刻蝕掩模層，如氧化硅、氮化硅、多晶硅和金屬層。這些問題的存在極大地限制了玻璃在微流控芯片加工領(lǐng)域的應(yīng)用。在此,我們采用商品化的ITO玻璃作為制作細(xì)胞培養(yǎng)芯片的基質(zhì)材料。ITO玻璃是鈉玻璃的一種，其所含的Na,O,CaO、MgO等雜質(zhì)成分可以大大加快玻璃濕法腐蝕的速度。同時(shí),為了簡(jiǎn)化制作工藝,降低成本，采用光刻膠AZ4620作為刻蝕掩模層;腐蝕液則采用1B稀釋的BOE液,最大刻蝕深度可達(dá)到110μm。如圖4所示,刻蝕時(shí)間與刻蝕深度呈較好的線性關(guān)系,平均刻蝕速度為066 μm/min。

圖4刻蝕時(shí)間對(duì)管道深度的影響

212ITO玻璃腐蝕中鉆蝕效應(yīng)的應(yīng)用 如前所述,在設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)芯片時(shí)必須考慮培養(yǎng)液流動(dòng)所導(dǎo)致的機(jī)械力影響。液體在微管道內(nèi)流動(dòng)所形成的剪切力除了導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變之外,嚴(yán)重時(shí)甚至可能損傷細(xì)胞。為了克服這一問題，SarunasM ichael等在芯片設(shè)計(jì)時(shí)采用柵形”結(jié)構(gòu)隔離培養(yǎng)液進(jìn)樣,出樣區(qū)域和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域,有效成分通過(guò)柵形”結(jié)構(gòu)擴(kuò)散完成,成功實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞在芯片上的培養(yǎng)同。在此,我們則是利用玻璃在濕法刻蝕過(guò)程中的鉆蝕效應(yīng)一次成型來(lái)獲得壩型”結(jié)構(gòu),優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)芯片的設(shè)計(jì)。

玻璃濕法刻蝕是各向同性的，即刻蝕過(guò)程中腐蝕液不僅刻蝕掉深度方向的材料，而且?guī)缀跻酝瑯拥乃俣瓤涛g掉側(cè)壁的材料,我們稱之為鉆蝕效應(yīng)。如圖1(6所示,若刻蝕時(shí)間較長(zhǎng),寬度較小的管道壁A將被腐蝕擊穿,形成壩型”結(jié)構(gòu),而寬度較大的管道壁B則未被刻穿。管道壁寬度越小,刻蝕時(shí)間越長(zhǎng)，壩型”結(jié)構(gòu)的高度越小。圖5為使用臺(tái)階儀測(cè)得的壩型”結(jié)構(gòu),其掩模板為圖2刻蝕深度A為39μm,“壩型”結(jié)構(gòu)高度為31μm。底部D最寬為178μm培養(yǎng)液灌注通道的寬度C為161μm。圖6為使用femlab對(duì)芯片內(nèi)液體的流速模擬分析得到的結(jié)果，紅色為流速較大處,藍(lán)色為流速較小處;其中A、B幅為壩型”結(jié)構(gòu)下結(jié)構(gòu)圖管道中部分別與進(jìn)樣方向平行、垂直的液體流速分布,左側(cè)為培養(yǎng)液進(jìn)樣通道,右側(cè)為細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域;C.D幅為沒有壩型”結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果。由圖6可見,使用壩型”結(jié)構(gòu)可以明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域液體的流速,從而減弱流體剪切力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。

圖5芯片內(nèi)“壩型”結(jié)構(gòu)圖

圖6不同結(jié)構(gòu)下芯片內(nèi)液體的流速模擬分

2.2細(xì)胞培養(yǎng)芯片與其他結(jié)構(gòu)的整合

2.2.1溫度控制 溫度控制是細(xì)胞培養(yǎng)微系統(tǒng)的重要組成部分,培養(yǎng)溫度若不適當(dāng),將會(huì)影響細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng),甚至使細(xì)胞死亡。目前,細(xì)胞芯片微系統(tǒng)的加熱源主要分為2類,即銅絲導(dǎo)電發(fā)熱的間接加熱方式和培養(yǎng)材料導(dǎo)電發(fā)熱的直接加熱方式四。為了滿足長(zhǎng)期觀察和記錄細(xì)胞活動(dòng)的需要,我們以 ITO玻璃上的 ITO薄膜為發(fā)熱材料,通過(guò)電極連入外部溫度控制系統(tǒng)。控制系統(tǒng)以ADμC812單片機(jī)為硬件核心,以PID增量算法為軟件控制算法,主要包括溫度信號(hào)采集、放大、濾波、單片機(jī)處理和反饋控制等功能。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，溫度控制目標(biāo)為37℃，使用Pto00電極在芯片表面采集溫度數(shù)據(jù),上下波動(dòng)小于05℃。

2.2.2 氣體供應(yīng) 多數(shù)細(xì)胞需要在有氧條件下生長(zhǎng)，一種可行的供氧方法是將培養(yǎng)液通過(guò)氧小室，溶解氧氣后再轉(zhuǎn)回至細(xì)胞培養(yǎng)芯片內(nèi),以此滿足細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所需要的氧氣。我們采用PDMS薄膜作為芯片的蓋片，除了利用它良好的生物兼容性之外，其高透氣性特點(diǎn)還可以滿足細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞對(duì)氧氣的需求同,使我們?cè)谂囵B(yǎng)時(shí)不需要增加額外的氣體供應(yīng)裝置,簡(jiǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)微系統(tǒng)的整體設(shè)計(jì)。根據(jù)Eric等的公式計(jì)算,若芯片內(nèi)細(xì)胞每秒需氧量估計(jì)值為XPDMS薄膜所能提供的氧氣量每秒最大值為Fm。本實(shí)驗(yàn)中，X約為1.36X10"mol/s Fm約為82X10mol/s F>>X,說(shuō)明采用PDMS薄膜完全可以滿足細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞對(duì)氧的需求。

細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí),除氧的供應(yīng)外,一般還需要5%的CO2分壓。由于本微系統(tǒng)未使用專門的氣體供應(yīng)設(shè)備,為此,我們采用改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)液的方法來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)CO?的需求，并提供穩(wěn)定的pH值.,添加LeibovitzsL-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)液在光照下具有高的穩(wěn)定性，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的pH值,足量的NaHCO:還能滿足細(xì)胞對(duì)碳酸鹽的需求。

23芯片細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試

芯片用75%酒精浸泡1h取出后放入培養(yǎng)皿中,紫外燈照射lh。為了有利于細(xì)胞導(dǎo)入芯片后貼壁生長(zhǎng),在導(dǎo)入細(xì)胞之前，用注射器將培養(yǎng)液注入芯片內(nèi)部,將芯片浸潤(rùn),放置過(guò)夜,使芯片內(nèi)壁包壁一層蛋白。培養(yǎng)液采用1640培養(yǎng)基,將其與L-15培養(yǎng)基以1：1混合后，補(bǔ)充10%的胎牛血清、100ug/mL鏈霉素。用消化液25g/L胰蛋白酶,02g/LEDTA溶液)將常規(guī)培養(yǎng)的PIEC消化、離心、吹打,將細(xì)胞懸濁液的濃度調(diào)整到4X10°/mm,然后用注射器吸入細(xì)胞懸濁液,通過(guò)注射泵緩慢注入芯片內(nèi)。將此已導(dǎo)入細(xì)胞的芯片和上述溫度控制系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、視頻觀察記錄系統(tǒng)相連，細(xì)胞在2~3h后貼壁生長(zhǎng)。圖7為培養(yǎng)72h后的細(xì)胞,其生長(zhǎng)情況良好;圖8為CCD記錄的細(xì)胞貼壁過(guò)程中形態(tài)的變化。

圖7芯片內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)

圖8細(xì)胞在芯片內(nèi)貼壁過(guò)程中的形態(tài)變化

24結(jié)語(yǔ)

本文介紹了一種利用ITO玻璃快速、低成本制作細(xì)胞培養(yǎng)芯片的方法。利用玻璃濕法刻蝕過(guò)程中的鉆蝕效應(yīng),在芯片內(nèi)加工出“壩型”結(jié)構(gòu),以分隔培養(yǎng)液進(jìn)樣通道和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域,減弱了培養(yǎng)液灌注過(guò)程中所產(chǎn)生的流體剪切力對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。將此芯片與透氣性的PDMS薄膜鍵合,并整和溫度控制系統(tǒng)、視頻觀察系統(tǒng)等,實(shí)現(xiàn)了PIEC在體外的培養(yǎng),為下一步研究細(xì)胞遷移特性等提供了良好的基礎(chǔ)。

免責(zé)聲明:文章來(lái)源豆丁網(wǎng) 以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。