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微流控芯片液滴生成與檢測技術研究進展

摘要: 微流控芯片液滴技術是一種操控微小體積液體的新技術,既可實現高通量微觀樣本的生成及控制,也可進行獨立液滴的操作。分散的微液滴單元可作為理想的微反應器,在生物醫藥中的藥物篩選、材料篩選和高附加值微顆粒材料合成領域展現出巨大的應用潛力。液滴微流控芯片是利用流體剪切力的改變,使互不相溶的兩相流體在其界面處生成穩定、有序的液滴,目前微液滴的生成方法主要有水動力法、氣動法、光控法和電動法等?;谝旱蔚奈⒘骺叵到y越來越多地被應用于執行復雜的多重反應、測量和分析,可以進行超小體積和超高吞吐量的化學和生物實驗。對液滴微流控系統而言,液滴的速度、大小和內容物含量會影響最終的檢驗結果,因此對液滴形成速率和液滴的內容物含量的實時檢測至關重要,目前最常用的液滴檢測方法有光學檢測技術與電學傳感檢測技術。對兩相流液滴生成機理以及現有液滴生成技術開展了討論分析,同時對液滴檢測技術進行了評述。

微流控技術作為一種在微觀尺寸下操控微量流體的技術,是一門新興交叉學科,涉及微機械、流體、物理、材料、生物、化學和生物醫學工程等眾多領域。微流控芯片作為微液滴生成的主要工具,具有生成液滴體積小、速度快、大小均勻、體系封閉以及單分散性良好等優勢。微流控芯片液滴技術的本質是利用流動剪切力或表面張力的改變,將兩種互不相溶流體中的離散相流體分割,分離成納升級及以下體積的微液滴,或者驅動微液滴運動。目前,微流控芯片液滴主要有兩種類型——微通道內運動的液滴和在平面上運動的“數字”液滴(按照順序在芯片表面傳輸,與數字微電子系統相似)。目前,微流控芯片中液滴生成的方法主要包括水動力法、氣動法、光控法和電動法等。其中當前液滴技術的主流是利用水動力法在微通道中生成液滴,具體又可細分為T型結構法、流動聚焦法和毛細管流動共聚焦法等。基于液滴的微流控技術具有制造成本低、樣品體積小、高通量、操作靈活和自動化等優點,已作為一種新的工具應用于分子檢測、藥物傳遞、診斷和細胞生物學等領域。該技術不僅可以產生均勻的液滴,而且還可以在液滴內進行化學反應和生物傳感,在液滴內可使兩種及以上不同組分液體進行充分混合反應,因此每個液滴可以被視為一個微型試管或反應器來獨立地進行反應和分析。

在基于液滴的微流控器件中,由于液滴的產生和操作涉及不連續的壓力變化,在液滴融合或裂變過程中,或在連續相的液滴形成過程中,液滴的大小、間隔和速度等可能在空間和時間上發生較大變化,故必須對其進行實時檢測。同時,液滴的濃度、生成頻率和成分等關鍵參數非常重要也需及時掌握,因此對液滴進行實時檢測至關重要。液滴檢測可用于樣品和試劑定位,并跟蹤樣品成分、濃度變化等。

液滴檢測常用的在線檢測方法主要有光學檢測與電學檢測兩種。其中,光學檢測多采用光學傳感器進行光信號或者圖像的采集,具有靈敏度高、檢測范圍大、便于后期軟件處理等特點而廣受歡迎,但因為光學檢測的外圍設備體積龐大、價格昂貴,故限制了其在微型器件中的應用。電學傳感檢測多采用電學量傳感器檢測液滴的電導率或者電容量等改變,具有成本低、體積小、靈敏度高、速度快、易于與芯片集成等優點,已在微流控系統中得到廣泛應用。

微液滴生成技術分類

微液滴的生成方式,根據是否有外部能量的參與可以分為被動式和主動式兩種類型。

1.1   被動液滴生成

微液滴的生成需要改變連續流動液體的狀態,使其分割為離散的單個微小液滴,其中液滴生成及操控中的關鍵是對微流體表面能進行控制。被動液滴的生成是指在液滴生成過程中僅存在流體的水動力壓力作用,無外部能量的輸入。通過微流控芯片微通道的結構設計,從外部注入不相溶的兩相或者多相流體實現液滴的生成,生成方法主要有T型結構法、流動聚焦法和毛細管流動共聚焦法等。

1.1.1   T型結構法

Thorsen等于2001年首次提出了一款帶縮頸的T型通道微流控芯片用于微液滴生成,如圖 1所示。油水兩相分別從芯片相應端口引入并流經T型結構交叉處,在T型結構處形成油/水界面,當油/水界面張力不足以維持油相剪切力時,水相斷裂形成液滴。Thorsen等提出將油/水界面之間的剪切力近似等于拉普拉斯力用于預測液滴尺寸,對于在55.16~154.44 kPa范圍內的油/水壓力下生成的單分散液滴,預測的液滴尺寸在實際液滴尺寸的2倍以內。Nisisako等以水為離散相,油為連續相,改變連續相流速(0.01~0.15 ms-1),在T型通道內生成直徑100~380 μm微液滴,且連續相與離散相流量比越大,微液滴生成頻率越快。張井志等研究了正T型微通道內液-液兩相流動特性及液滴生成規律。綜上所述,T型微通道結構簡單,但芯片中的縮頸結構加工難度較大,且受剪切力和表面張力的影響T型微通道中液滴生成穩定性較差,液滴尺寸控制范圍較窄。

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1.1.2   流動聚焦法

相比T型結構法中從單側擠壓離散相流體,流動聚焦法中的連續相是從兩側對離散相進行擠壓,在下游縮頸通道處油/水界面失穩形成液滴。如圖 2所示,為Anna等提出的平面流動聚焦微流控芯片,該芯片中間為水相流路,兩側對稱流路為油相通道,離散相水溶液通過兩側油相的擠壓,在通道下游的小孔(43.5 μm)內部或者小孔下游斷裂形成液滴,其中液滴的大小與孔板的大小近似,可生成最小液滴尺寸為幾百納米,但當液滴在孔口下游相撞時,會發生聚結。在后期研究中,Joanicot等設計了如圖 3所示的十字交叉結構流動聚焦微流控芯片,該芯片在十字交叉處下游主通道處增加了縮頸設計。針對芯片結構設計的重要性,劉趙淼等[18]研究了微液滴生成直徑及其生成周期各個階段與通道深度、縮頸段長度以及兩相夾角等結構因素的關系,流動聚焦法合成微液滴的過程受兩相夾角θ的影響較大,當θ=90°時,液滴尺寸及生產頻率均達到最優。相對T型結構法,流動聚焦法中液滴生成更加穩定,生成的液滴尺寸可控范圍更寬,更容易生成遠小于通道尺寸的液滴。然而流動聚焦法要求芯片結構高度對稱性,縮頸處尺寸更小,加工工藝精度要求較高。

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2.  平面流動聚焦芯片

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3.  十字交叉流動聚焦芯片

1.1.3   毛細管流動共聚焦法

在芯片制作過程中,毛細管流動共聚焦法不需要用于微通道加工的光刻技術或者超凈實驗室,比前兩種方法簡單;在結構上該方法利用毛細管的嵌套關系使連續相環繞離散相從四周徑向“擠壓”形成“收縮頸”,使離散相流體前端“失穩”,從而生成液滴。

Cramer提出了用鋼制毛細管注入離散相的流動共聚焦裝置,并證實了兩種不同的液滴生成機理,一是滴流原理,二是噴射原理。與Cramer等[19]不同,Utada等提出了一種用于制備單離散相乳液及多核乳液的玻璃毛細管裝置,該裝置結構設計見圖 4A所示。通過改變外部注入流體方向,利用流體動力能聚焦實現液滴生成,如圖 4B所示。毛細管流動共聚焦法還便于生成多核液滴,圖 4C為雙核液滴生成示意圖。此外,在無需對管壁進行修飾的情況下,還可以將多級毛細管串聯起來,生成多核液滴。但由于結構較為復雜,在毛細管共軸和流體引入方面有一定難度。Chen等提出一種獨特的玻璃毛細管封裝方法來生成多核液滴。在該裝置中方形毛細管作為外部管,外部管的兩端分別安裝一個錐形管,如圖 5所示,圖中虛線箭頭標注了不同流體的流向。王洪等提出了一種組合式的共流聚焦液滴生成方法——T型共流聚焦法,可生成平均體積為8.9 nL的液滴,并借助商品化的T型管簡化了傳統毛細管流動共聚焦液滴生成裝置封裝難的問題。總結上述研究可知,在穩定生成液滴方面流動共聚焦方法比前兩種方法具有更大的優勢,且液滴尺寸可控范圍更寬廣;但其不足是兩相流注入難,如Utada和Chen等提出的設計,裝置封裝體積較大,不如T型結構法和流動聚焦法便捷,同時毛細管之間能否共軸也成為一個難點。

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1.2   主動液滴生成

主動控制法是通過在液滴生成過程中加入外部能量來控制微流體的表面能。主動液滴生成方法較多,主要包括磁力控制、機械控制]、熱控法和電控法等。下面將對這幾類主動液滴生成方法進行簡述。

1.2.1   磁力控制

磁力在微液滴的生成和控制中的應用主要依賴于特殊流體(磁性流體)對磁場的體積動態響應。磁性流體是一種含有懸浮磁性顆粒的液體,例如鐵磁流體。鐵磁流體具有超順磁性,可以被磁化而沒有磁性記憶,一旦外部磁場被移除鐵磁流體中的納米顆粒就會變得無磁性。鐵磁流體既可以是水基的,也可以是油基的,被用作離散相和連續相均可。在微通道中通過磁力控制生成微液滴主要是基于被動控制中的T型結構和流動聚焦結構芯片來實現的。圖 6所示為Tan等提出的基于T型結構的水基磁流體液滴生成裝置示意圖,其中永磁體的位置可以放置在T型結構處的上游和下游, 液滴的直徑可以通過磁場梯度、磁流體的磁化強度和磁體的相對位置來控制。無永磁體時液滴直徑為230 μm;永磁體的位置放置在T型結構處的上游時,隨磁通量密度的增加液滴直徑可達280 μm;永磁體的位置放置在T型結構處的下游時,隨磁通量密度的增加液滴直徑可減小至190 μm。因為磁力控制液滴產生時需要特殊流體,故只適用于磁性流體,而不適用于大部分無磁性流體。

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1.2.2   機械控制

機械控制微液滴生成過程中涉及到流體界面的物理變形,引發流體界面變形的動力來源包括液壓、氣動、壓電等方式。如液滴生成過程中的機械部件由液壓和氣動操控,通常由集成到微流體裝置上的閥門執行流路的通斷控制。2009年,Zeng等提出了基于T型結構的集成氣動PDMS微閥的設計,如圖 7A所示,用于控制水相流體實現液滴生成,可生成液滴的最小體積為1.3 nL。在該裝置中,通過依次打開或關閉微閥可按需生成單個液滴。此外,通過擴展水流通道數量并集成相應的氣動泵微閥,加以時序控制,可輕松生成具有不同成分的液滴陣列,如圖 7B所示。壓電驅動相比液壓和氣動驅動具有響應時間更快的獨特優勢。

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1.2.3   熱控法

熱控法實現液滴生成及控制的能量來源包括結點處采用電阻加熱和利用聚焦激光束實現局部加熱,其本質是利用流體的溫度依賴特性,大多數流體粘度和界面張力會隨著溫度的升高而降低,而這二者的變化最直接的反映是毛細管數(Capillary number, Ca)的變化。Nguyen等首先介紹了利用電阻加熱來控制液滴生成的尺寸,其結構設計如圖 8所示。通過使用集成的微型加熱器和溫度傳感器控制微流控裝置中熱量的施加,從而控制液滴的產生方式和液滴尺寸, 使用25~70 ℃的相對較低的加熱溫度,液滴直徑可調節到其原始值的2倍以上。圖 9為Baroud等采用聚焦激光束局部加熱微通道,從而實現液滴產生的裝置示意圖;相比Nguyen的方法,激光加熱更加靈活,可以輕松調整聚焦激光點的位置,從而精確地實現液滴產生部位的局部加熱。

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1.2.4   電控法

所謂電控法就是通過對微通道中的流體施加電壓來實現微液滴的生成及控制。可供選取的電壓來源交直流均可,對于直流(DC)控制,在液滴生成的整個過程中電壓保持恒定;在交流(AC)控制中,電壓的波動頻率與液滴的產生頻率不同,對于高頻交流控制,控制信號的頻率遠高于液滴生成的頻率。在通過施加電壓控制液滴生成的芯片中,施加電壓的電極與液體接觸。Link等提出了如圖 10所示的液滴生成芯片設計,芯片中采用直流電壓控制液滴生成。該平面流動聚焦芯片流路底部包含兩個用于驅動電壓接入的氧化銦錫(ITO)電極,電極與流體直接接觸,液滴的大小可通過調節電壓大小來控制,同樣,該裝置也可用交流電壓控制液滴生成。這種裝置設計最大的缺點是電極與流體接觸容易產生污染,并且生成的液滴為帶電液滴,不利于在生化樣品中應用。目前,常規電控法設計中電極仍與液體接觸,因此須引入介電材料隔開流體以防止電極污染或液滴帶電。

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Castro-Hernandez等提出一種不同于傳統電控法的裝置設計,如圖 11所示,所有電極均不與液體接觸,通過電控法生成液滴。該裝置使用頻率高達50 kHz的交流電進行液滴生成控制,電壓越高射流長度越大,生成液滴體積越小。此外直流電也可用于介質上電潤濕(EWOD)效應當中,而且交流電具有減少接觸角滯后的優勢。實驗結果表明,液滴的大小與油-水界面和下游電極之間的電壓差有關。

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2.   液滴檢測技術

早期微流控裝置中生成液滴的狀態,例如大小、間距長度和數量等,常需人工離線檢測或計量,此方法費時費力無法實時檢測液滴狀態。研究者們陸續開發出了實時在線的檢測方法,目前對液滴的在線檢測方法主要有光學檢測和電學傳感檢測[35]兩種。

2.1   光學檢測

目前為止,光學檢測應用最為廣泛,主要有熒光、化學發光、衍射、吸收和折射率變化等檢測技術,可以對液滴進行計數、檢測液滴的生成頻率、運動速率和液滴內容物含量,可使用光電二極管進行簡單計數,或使用高速電荷耦合器件(CCD)相機進行圖像處理以檢測更詳細的特性。Nguyen等使用光電二極管對液滴的大小、形狀和生成頻率進行了檢測。利用激光誘導熒光技術(LIF)所具有的高靈敏度,Jiang等實現了微流控芯片的高通量分析,如圖 12所示。Basu等提出了液滴形態測量和速度測量(DMV)的視頻處理算法,如圖 13所示,通過逐幀視頻分析創建每個液滴的大小、軌跡、速度、變形、像素統計和其時間歷程參數,不需要傳統的PIV(粒子圖像測速)設置或熒光跟蹤器。陳海秀等提出了一種基于液滴輪廓的圖像液滴分析技術,通過CCD相機拍攝得到液滴外形輪廓,再用圖像處理技術對微液滴的邊界進行特征采樣,通過計算得到特征參數權值。該技術屬于非接觸式測量不會產生二次污染,但只能測量靜止狀態下的液滴且檢測速度較慢。光學檢測中使用最廣的是激光誘導熒光檢測,也是目前檢測靈敏度最高的微流控檢測方式之一。除了被檢測的芯片,光學檢測通常需要龐大或昂貴的組件和熒光標記,而且光學技術也不能用于不透明的基底上,這既增加了系統復雜性和成本也降低了系統的集成度。雖然光學檢測能夠檢測較高頻率的液滴,但其抗干擾能力差、標記易猝熄,因此需要開發更加簡單而廉價的技術來在線表征液滴。

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2.2   電學傳感檢測

電學傳感檢測是目前正在快速發展的一種在線微液滴檢測技術,多采用電學量傳感器檢測液滴的電導率或者電容量等改變,已在微流控系統中獲得廣泛應用。電學傳感檢測所使用的微型電極,具有靈敏度高、響應快,易于集成的優點,可以使整個芯片系統更加緊湊,推動了數字微流控設備的微型化。電學傳感技術可以使用商售的低成本電子元件進行高靈敏度的液滴含量檢測,可以檢測液滴大小和速度,并可對液滴進行計數。由于水的電導率和介電常數明顯高于油,所以電學傳感在檢測液滴大小、速度和內容物含量等參數時,主要有基于阻抗的電學傳感技術和和電容耦合式非接觸電導檢測。

2.2.1   基于阻抗的液滴檢測技術

學者們利用電極間存在液滴會引起電極電阻變化的規律,開發了阻抗式液滴檢測技術。楊文棟[47]研制了基于液滴阻抗檢測的微流控芯片,完成了對液滴速度、體積與內含物濃度的檢測,結合光學信號與電學信號,精確地求得了液滴的速度與體積。Luo等通過對微電極施加交流(AC)電壓,利用液滴介電常數隨著其組分離子濃度變化的特性,可以檢測0.02 mmol/L到1 mol/L的NaCl液滴的濃度。基于電阻傳感的檢測方法需要不導電的連續相來襯托液滴的電阻變化, 當連續相將液滴與電極分離,液滴與電極不存在接觸時電極電阻變化非常小,這就增大了檢測難度。在大多數應用中,應盡可能的防止液滴被電解和滯留在微流體通道內,為避免交叉污染,電極與液滴不應直接接觸,這些都限制了電阻檢測的應用場合。

2.2.2   電容耦合式非接觸電導檢測

液滴的電容檢測是一種電容耦合式非接觸電導檢測,液滴和電極表面之間沒有任何接觸。當液滴進入傳感區域時,會導致電極之間的電容量發生變化,目前大部分研究都使用共面電極的電容耦合式非接觸電導檢測方式,對液滴各項參數進行測量。

Elbuken等利用電容式傳感器檢測液滴的存在,共面電極通過微流控通道形成電容,液滴通過電極時會引起電容量變化。單對電極可用于檢測液滴的存在,叉指電極可用于實現液滴尺寸和速度的檢測。Niu等提出了一種基于液滴與連續相介電常數差異的電容耦合式非接觸電導檢測方法,通過在微流控通道上安裝一對平行電極,當液滴通過時,可以檢測到電容的微小變化, 其工作頻率可達10 kHz,是傳統的光學檢測難以實現的。通過電容的變化可以實時準確地檢測液滴的大小、速度和液滴組分,并根據液滴的大小和組分對其進行控制和分類。如圖 14所示,不同大小液滴通過電極時對應的電信號也不同。Demori等提出了一種嵌入電容傳感電極的微流控器件,通過介電常數差異對微通道中的流體進行識別和表征,當在微通道中注入不同流體時,該系統能夠區分不同溶質組分的純樣品和混合物,并估計其介電常數。Hu等使用微膜電極在液滴不與連續相分離的情況下對液滴進行電化學檢測,可以單獨檢測每個液滴中的電活性物質。Isgor等利用Y型結構混合乙醇和去離子水,形成濃度不同的乙醇液滴,利用共面電極、電容傳感器和微處理器實現了高靈敏度液滴組分含量的檢測,如圖 15所示,液滴電容值隨乙醇濃度的增加而減小。

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3.   結論與展望

微流控芯片液滴技術既可使宏觀樣品生成數以萬計的微液滴,提供一種在單分子量級快速開展超大規模、超低含量反應的平臺,也可對生成的單個或數個液滴進行操控。獨立的微液滴單元可作為微反應器,進一步增強了微流控芯片低消耗、自動化和高通量等優勢,并且微液滴在控制方面靈活、形狀可變、大小均一,具有優良的傳熱傳質性能,在醫學、化學、生物學、藥物篩選和材料篩選等領域具有巨大的應用潛力。但微流控液滴技術仍面臨著微液滴運動的自動化、微液滴體積可控制生成等挑戰。近年來,隨著生物芯片技術的發展,微流控技術作為生物芯片的一項關鍵支撐技術得到了人們越來越多的關注,數字微流控技術已成為微流控芯片液滴技術新的分支,并在不斷的發展壯大。

在液滴微流控系統的開發和應用中,對液滴含量進行實時定性和定量分析的能力越來越重要。電學傳感是利用微電極傳感器上不同液相通過時其阻抗或電容的變化來實現液滴狀態檢測的技術,液滴的化學信號可以通過電極轉變為電信號輸出,除了測量液滴的大小和產生頻率外,還可以利用電學傳感分析液滴的組成和濃度等,進一步可以根據液滴的特性來對液滴實施控制。相對于傳統的光學檢測技術來說,電學傳感器可以用標準的光刻技術制造,與現有常用微流控器件的加工技術相兼容,這有利于微流控芯片進一步微型化。

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