1. RT-LAMP 芯片設(shè)計(jì)

如圖 1d 所示，芯片由 1mm 或 2mm 厚的 PC 組成。在將所有 PC 層組裝之前用 VISTEX 溶液處理 PC 層上的虹吸通道，使其表面為親水性。

在進(jìn)行 RT-LAMP 反應(yīng)之前，將厚厚的 PC 蓋放在組裝好的芯片上避免芯片在 RT-LAMP 過(guò)程中彎曲。如圖 1d 所示，PC 蓋上三個(gè)半徑為 5mm 的孔與 RT-LAMP 腔對(duì)齊以實(shí)現(xiàn)有效的熱傳遞。

芯片結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。將三個(gè)儲(chǔ)液池(用于 RNA 樣品，洗滌液和洗脫液存放)放置于捕獲 RNA 的珠床通道前面。在右側(cè)，設(shè)計(jì)了另一個(gè)用于裝載 RT-LAMP 混合物的腔室，其中包含酶混合物，目標(biāo)特異性引物和反應(yīng)緩沖液。

在 RNA 樣品入口的內(nèi)部設(shè)計(jì)了毛細(xì)管閥( 深: 100um， orange )，以防止回流到洗滌和洗脫液腔。

一個(gè) 100um 深的堰結(jié)構(gòu)用來(lái)填充經(jīng) TEOS 處理的微珠(直徑為 150–212μm )，注: 此處文章應(yīng)該有誤，微珠比堰大肯定進(jìn)不去。

洗滌液腔通過(guò)毛細(xì)管閥( 深: 150um ; 寬: 580um， brown )與珠床微通道連接。一個(gè)虹吸通道( 深: 100um ; 寬: 580um， orange )橋接在洗脫液腔和珠床微通道之間。洗脫腔中的毛細(xì)管閥用于安全地儲(chǔ)存液體，而在洗脫腔中使用虹吸管道是為了按序加載 RNA 樣品，洗滌液和洗脫液。

類似地，RT-LAMP 混合液也使用毛細(xì)管閥和虹吸通道，以便在加載洗脫液之前將 RT-LAMP 混合液移至 RT-LAMP 腔。

本文設(shè)計(jì)的洗滌和洗脫腔，可將溶液穩(wěn)定地儲(chǔ)存在指定位置。如，所用洗滌液為 70% 乙醇，其接觸角較低。由于 70％ 乙醇的高潤(rùn)濕性，使得裝載的洗滌液通常會(huì)沿通道壁不受控制地運(yùn)動(dòng)。為了防止這種隨機(jī)流動(dòng)，設(shè)計(jì)了如圖 1b(i) 的洗滌腔。

一個(gè)可產(chǎn)生強(qiáng)大毛細(xì)作用力的環(huán)形結(jié)構(gòu)( 深: 200um )被提出，該毛細(xì)力可以承受液體壓力，抑制洗滌液的泄漏。圖 1b(ii) 顯示了洗滌腔的底視圖，包含了內(nèi)圈和外圈圖案。

為避免洗滌液注入過(guò)程中頂部密封帶被弄濕，制作了一個(gè) 250μm 深的圖案，確保了膠帶的完美密封，從而消除 RT-LAMP 過(guò)程中的污染和蒸發(fā)問(wèn)題。

洗脫腔和 RT-LAMP 腔也設(shè)計(jì)了一個(gè)具有 250μm 深度的環(huán)形圖案，以在注入步驟中牢固地儲(chǔ)存液體，如圖 1c 所示。

廢液腔的入口包含三個(gè)毛細(xì)管閥( 深: 150um ; 寬: 580um，長(zhǎng): 1000um)，以防止廢液倒流到珠床微通道或 RT-LAMP 腔中。RT-LAMP 反應(yīng)腔的體積為 6 μL，通過(guò)虹吸通道與 RT-LAMP 儲(chǔ)液腔直接相連。實(shí)驗(yàn)上，RT-LAMP 混合物比純化的 RNA 溶液傳輸?shù)?RT-LAMP 反應(yīng)腔的速度更快。

圖 1 芯片描述

2. 試劑準(zhǔn)備

如圖 2a 所示，將 RNA 樣本 (甲型流感病毒裂解物或純化的病毒 RNA)，洗滌液( 70％ 乙醇 )，洗脫液 ( RNase-free water ) 和 RT-LAMP 反應(yīng)混合物引入指定的腔室。其中，3.5μL 的 RNA 樣品包含 0.5μL 甲型流感病毒樣品，1.25μL 乙醇和 1.75μL 6 M Gu-HCl 。

將樣品加載到各個(gè)腔室后，RNA 溶液 ( yellow ) 因珠床微通道的親水性和毛細(xì)作用力被自動(dòng)吸收到珠床微通道中，而位于進(jìn)樣口上側(cè)的毛細(xì)管閥可防止樣品溶液倒流到洗滌或洗脫液腔中。然后，將 5μL 洗滌液（70％乙醇，blue），2.2μL 洗脫液（RNase-free water，sky blue）和 4.4μL RT-LAMP反應(yīng)混合物（green）分別裝入對(duì)應(yīng)腔室。為了阻止溶液的溢出和蒸發(fā)，使用一塊粘合膜 (adhesive film) 覆蓋儲(chǔ)液腔和通風(fēng)孔。

圖 2 芯片的操作流程

3. 芯片操作

珠床微通道中的 RNA 樣品以每分鐘 5000 轉(zhuǎn)的速度逆時(shí)針流動(dòng) 10 s 。如圖 2b(i) 所示 (yellow) 目標(biāo) RNA 和一些雜質(zhì)被捕獲在堆積的微珠上。然后通過(guò)洗滌溶液去除殘留在珠床上的鹽和蛋白質(zhì)，從而純化捕獲的 RNA, 如圖 2b(ii) 所示 (blue)。

隨后以 5000 RPM 的速度離心 290 s (逆時(shí)針) 用來(lái)干燥微珠中殘留的乙醇，防止抑制后續(xù)的擴(kuò)增。此時(shí)來(lái)自 RNA 樣品的廢液和洗滌液被運(yùn)送到廢液腔。由于離心力和科氏力產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力使得廢液流向廢液腔，而不是 RT-LAMP 反應(yīng)腔。如下視頻 1 對(duì)此作了解釋。

在低轉(zhuǎn)速下，科氏力不足以進(jìn)行流動(dòng)切換，因此本文采用了較高的旋轉(zhuǎn)速率，如±5000 轉(zhuǎn)/分。當(dāng)芯片停止旋轉(zhuǎn)時(shí)，如圖 2b(iii) 所示, 在 30 s 內(nèi)將 the RNase-free water 和 RT-LAMP 混合物灌注至虹吸通道。

如圖 2b(iv) 所示, 當(dāng)轉(zhuǎn)速沿順時(shí)針?lè)较蛟黾又?5000 RPM 時(shí)。the RNase-free water 和 RT-LAMP 混合物開(kāi)始流動(dòng)。RT-LAMP 混合物更早地流動(dòng)到 RT-LAMP 反應(yīng)腔中，the RNase-free water 通過(guò)珠床微通道隨后將純化的 RNA 輸送到 RT-LAMP 反應(yīng)腔中。

由于此時(shí)的旋轉(zhuǎn)方向與初始相反，因此攜帶純化 RNA 的 the RNase-free water 被移至 RT-LAMP 反應(yīng)腔，而不是廢液腔。該步驟被延長(zhǎng) 90 s，以完全回收微珠上的RNA，如圖 2(iv-vi) 所示。

最后，如圖 2c 中的藍(lán)綠色所示在 RT-LAMP 反應(yīng)腔中收集了總共 6μL 的 RT-LAMP 反應(yīng)混合物 (4μL 的 RT-LAMP 混合物和 2μL 純化的RNA溶液）。如下視頻 2 對(duì)反應(yīng)流程做了詳細(xì)說(shuō)明。隨后 RT-LAMP 反應(yīng)直接在 64.2°C 下進(jìn)行 40 min 。

圖 3. 流體流動(dòng)順序

4. 洗滌腔中環(huán)形圖案深度的計(jì)算

洗滌腔中環(huán)形圖案深度被計(jì)算如下：

由于總體積是腔室體積(Vch)和毛細(xì)管通道體積(Vca)的總和，

所以不等式可以按深度 (d) 排列，得到 d 的最大值如下

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