大家好！為大家介紹一篇2019年發(fā)表在Nat. Biomed.Eng.上的文章，題目為“Leukocyte function assessed via serialmicrolitre sampling of peripheral blood from sepsis patients correlates with disease severity”。本文主要介紹了一種慣性微流控系統(tǒng)，用于從較少量敗血癥患者外周血中白細(xì)胞的分離和下游分析。通訊作者是來自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Bruce D. Levy教授，研究興趣是微流控方向的醫(yī)療設(shè)備開發(fā)與疾病診斷。

【背景介紹】

敗血癥引起的炎癥性異常，是病原體感染致死的首要原因。在健康的患者中，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞是該病癥早期的應(yīng)答者，在抵抗病原體、限制組織損傷、促進(jìn)器官功能恢復(fù)和體內(nèi)平衡等方面具有重要作用。一般情況下，監(jiān)控敗血癥患者情況主要通過觀察臨床狀況和外周血中白細(xì)胞計數(shù)，但該方法無法獲得白細(xì)胞功能的相關(guān)信息，不能準(zhǔn)確地評估療效。此外，也可通過序貫器官衰竭估計評分（SOFA）評價敗血癥嚴(yán)重程度，但是該方法的誤診率較高（~30%），且無法提供病理學(xué)信息；或采用即時檢測型微流控芯片檢測循環(huán)細(xì)胞因子等，但依然無法有效地預(yù)測疾病的嚴(yán)重程度。由于白細(xì)胞必須結(jié)合各種不同的環(huán)境信號來做出保護(hù)型功能反應(yīng)，它們的活性和功能可以作為疾病的細(xì)胞生物標(biāo)志物。對白細(xì)胞的下游分析，可以為人類敗血癥和炎癥性疾病的治療提供新的策略。然而，頻繁地進(jìn)行全血細(xì)胞計數(shù)可能會導(dǎo)致患者貧血，尤其是重癥患者。因此，開發(fā)樣品需求量較少的白細(xì)胞分析檢測方法具有重大意義。

【設(shè)計思路】

本文中所用無標(biāo)記分離白細(xì)胞的慣性微流控系統(tǒng)如圖1所示，全血用量為50 μL。所用微流控芯片為螺旋芯片，其特別之處在于其螺旋通道的橫截面為梯形，如圖1a中X和Y截面圖所示。螺旋型流道的外側(cè)部位（接至OW outlet）高于內(nèi)側(cè)部位（接至IW outlet），造成流道內(nèi)外側(cè)的流體線速度不同。稀釋后的血樣注入流道后，不同尺寸的細(xì)胞在迪恩曳力和慣性升力的共同作用下發(fā)生重排，尺寸較大的白細(xì)胞傾向于沿流道高度較小的流道內(nèi)側(cè)遷移，而尺寸較小的紅細(xì)胞將沿流道外側(cè)遷移，逐漸實現(xiàn)白細(xì)胞與紅細(xì)胞的分離。從OW outlet流出的紅細(xì)胞直接進(jìn)入廢液管中，而從IW outlet收集的白細(xì)胞，又再次反饋至樣品管，重新進(jìn)入螺旋芯片再次分離，直至獲得較高純度的白細(xì)胞。

圖1 慣性微流控系統(tǒng)用于分離全血中的白細(xì)胞原理圖，及其與密度梯度離心法分離效果的對比

【數(shù)據(jù)介紹】

1. 多型核中性粒細(xì)胞的分離及其在敗血癥患者和健康人中的作用作者首先測定了多型核中性粒細(xì)胞（PMN）表面的CD11b，CD66b和CD18的表達(dá)量，以評估慣性微流控芯片對PMN激活性質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，慣性微流控芯片分離獲得的PMN激活水平與處理前的細(xì)胞無顯著差異，且均顯著低于通過密度梯度離心法獲得的PMN，表明慣性流微流控芯片比密度梯度離心法更適合用于分離全血中的白細(xì)胞。為研究經(jīng)慣性流微流控芯片分離后的PMN的應(yīng)激能力，以確定該微流控芯片對PMN活性的影響，作者分別測定了PMN的脫顆粒作用、NADPH氧化酶組裝和吞噬溶酶體的形成。作者通過測定經(jīng)十四烷酸佛波醇酯（PMA）刺激后的PMN中彈性蛋白酶釋放水平，以評估PMN的脫顆粒作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從健康人全血中獲得的PMN經(jīng)PMA刺激后彈性蛋白酶釋放水平顯著提高，且具有劑量依賴性（圖2a）。此外，白三烯B₄（LTB₄）刺激也可顯著提高PMN彈性蛋白酶的釋放水平。進(jìn)一步地，作者分析了敗血癥患者血液中獲得的PMN的應(yīng)激性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LTB₄刺激后，從敗血癥患者血液中分離的PMN彈性蛋白釋放酶水平顯著低于健康人的PMN。但經(jīng)PMA刺激后，敗血癥患者和健康人PMN的彈性蛋白釋放酶水平相當(dāng)（圖2b和c）。

 2. PMN亞群的研究作者通過測定敗血癥患者和健康人血液中PMN表達(dá)CD16的情況，研究了PMN的亞群分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敗血癥患者血液中CD16^-和中表達(dá)CD16的PMN比例升高，而高表達(dá)CD16的PMN比例降低，且發(fā)現(xiàn)CD16^-和中表達(dá)CD16的PMN比例與敗血癥的嚴(yán)重程度正相關(guān)，而高表達(dá)CD16的PMN比例與疾病嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)。

圖2 中性粒細(xì)胞亞群（PWN）及其在敗血癥和健康患者中的作用

3.等介電法分離敗血癥患者和健康人血液中PMN等介電法（IDS）可測定PMN的等電位，以鑒別靜息細(xì)胞和激活細(xì)胞。因此本文中采用IDS法分析了敗血癥患者和健康人血液中的PMN，以期通過IDS鑒別敗血癥患者和健康人。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敗血癥患者血液中未激活的PMN的等電位顯著低于健康人血液中的PMN（圖3c和d）。而經(jīng)PMA激活后，健康人的PMN的等電位將降低至敗血癥患者的水平。進(jìn)一步地，作者還發(fā)現(xiàn)，PMN的等電位與敗血癥嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)（圖3f）。

圖3 IDS法鑒定敗血癥患者和健康人血液中PMN的等電位

4.敗血癥患者和健康人血液中單核細(xì)胞亞群單核細(xì)胞在敗血癥發(fā)生過程的宿主反應(yīng)中有重要作用。因此本文中還分離獲得了單核細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，確認(rèn)慣性流微流控芯片對單核細(xì)胞在全部白細(xì)胞中的比例沒有影響。隨后，作者通過分析CD45⁺ FSC⁺ SSC^?以及CD14和CD16水平，以研究單核細(xì)胞的亞群（圖4a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敗血癥患者血液中中間單核細(xì)胞的比例顯著高于健康人，而經(jīng)典單核細(xì)胞比例卻顯著低于健康人，但兩者的非經(jīng)典單核細(xì)胞比例無顯著差異（圖4a和b）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典單核細(xì)胞的比例與敗血癥嚴(yán)重程度呈反相關(guān)（圖4c）。

圖4 敗血癥患者和健康人血液中單核白細(xì)胞亞群分析

5.敗血癥患者的臨床癥狀與白細(xì)胞參數(shù)的主成分分析作者利用主成分分析法分析了敗血癥患者血細(xì)胞（包括總白細(xì)胞、PMN、帶細(xì)胞和單核白細(xì)胞）、臨床疾病嚴(yán)重程度、白細(xì)胞表型亞群和白細(xì)胞功能的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用血細(xì)胞參數(shù)無法區(qū)分?jǐn)⊙Y患者和健康人（圖5a）；采用臨床疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)綜合評分，包括血壓、人工呼吸需求、APACHE II和SOFA評分，確實可以區(qū)分?jǐn)⊙Y患者和健康人（圖5c和d）。更重要的是，采用白細(xì)胞表型標(biāo)志物的綜合評分，不但能準(zhǔn)確鑒別敗血癥患者和健康人，還能診斷敗血癥的患病時間（圖5e~h）。此外，高表達(dá)CD16的PMN、經(jīng)典單核細(xì)胞和白細(xì)胞和PMN功能性應(yīng)激的綜合評分，以及PMN功能性應(yīng)激和等電位的綜合評分，均可有效區(qū)分?jǐn)⊙Y患者和健康人。

圖5 主成分分析用于研究敗血癥患者嚴(yán)重程度與白細(xì)胞參數(shù)相關(guān)性

【總結(jié)】

本文中開發(fā)了一種慣性微流控芯片平臺，用于從微升級別的全血樣品中，無標(biāo)記地分離出白細(xì)胞。該方法具有所需樣品量少、耗時短、對白細(xì)胞應(yīng)激性能影響小等優(yōu)勢。進(jìn)一步地，利用該芯片分離獲得的白細(xì)胞（包括PMN和單核細(xì)胞），分析了白細(xì)胞數(shù)量、等電位、亞群占比等與敗血癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)采用白細(xì)胞表型標(biāo)志物的綜合評分，不但能準(zhǔn)確鑒別敗血癥患者和健康人，還能診斷敗血癥的患病時間，為敗血癥的診斷和療效評估、預(yù)后等提供了新方法。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-019-0473-5

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