作者：肖星凝

常用的PCR檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳和實(shí)時定量PCR (qPCR)。瓊脂糖凝膠電泳是一種簡單、成本低廉的方法，結(jié)果直觀，但只能說明產(chǎn)品的存在性和純度。qPCR是一種半定量檢測核酸的方法，已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院。然而，qPCR對DNA濃度的絕對定量需要一系列標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線，增加了整個實(shí)驗(yàn)的成本和復(fù)雜度。此外，當(dāng)PCR擴(kuò)增在體反應(yīng)中進(jìn)行時，定量罕見的靶標(biāo)是困難的，在體反應(yīng)中，大量的非靶標(biāo)序列與靶標(biāo)競爭PCR引物。因此，qPCR在檢測循環(huán)腫瘤DNA和罕見突變DNA等方面存在不足。

新興的高靈敏度數(shù)字PCR(dPCR)技術(shù)具有絕對準(zhǔn)確的定量分析優(yōu)勢，是一項(xiàng)很有發(fā)展前途的技術(shù)。在該技術(shù)中，DNA樣品被稀釋并分割成大量的平行小室，大部分的共組分要么含有單個目標(biāo)DNA，要么不含有目標(biāo)DNA，從而可以對單個目標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增并分別檢測到。定量的“是或否”終點(diǎn)信號被用來對陽性和陰性的區(qū)隔進(jìn)行評分，因此通過對陽性區(qū)隔的計數(shù)，dPCR可以確定一個復(fù)雜種群中存在的初始DNA靶點(diǎn)的總數(shù)。現(xiàn)有的dPCR技術(shù)一般分為兩大類:基于drop-baseddPCR(ddPCR)和基于chamber-based dPCR (cdPCR)。 ddPCR具有最高的靈敏度和準(zhǔn)確性，因?yàn)樗梢詫?shí)現(xiàn)乳液中反應(yīng)液滴的數(shù)量最多，但這種平行液滴群體的生成和轉(zhuǎn)移需要時間和復(fù)雜的操作。cdPCR有許多預(yù)制的微、納米或皮升油層。與ddPCR相比，cdPCR具有包間大小均勻、加載樣品速度快、交叉污染最小等優(yōu)點(diǎn)。

然而，復(fù)雜的制造工藝增加了成本，限制了腔室的數(shù)量。此外，這些dPCR方法大多使用熒光團(tuán)作為信號標(biāo)簽，需要昂貴的高靈敏度熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀等專用儀器進(jìn)行信號檢測，可能面臨高背景噪聲等挑戰(zhàn)。因此，一種低成本、低背景噪聲、簡單靈敏的dPCR方法仍然是滿足dPCR作為常規(guī)程序在正常流產(chǎn)和臨床應(yīng)用中的迫切需要。光束法是一種乳化液數(shù)字PCR技術(shù)。在光束傳輸中，單個目標(biāo)DNA被放大到單個磁珠上，磁珠被包裹在油包水(W/O)乳劑的液滴中。擴(kuò)增后，將目標(biāo)DNA的群體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)磁珠的群體，磁珠上覆蓋著成千上萬的目標(biāo)DNA拷貝。通過對靶珠數(shù)量的計數(shù)，可以確定靶DNA的初始數(shù)量。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新的基于波束形成、微球和微柱陣列芯片的dPCR方法，原理圖如下。

圖1 (a)和(b)混合磁珠和上游引物及樣品；(c)乳化混合物及聚合酶鏈反應(yīng)； (d)放大單目標(biāo)DNA；(e)液滴破碎；(f)捕獲改性聚苯乙烯微球；(g)從微球上分離游離磁珠；(h)捕獲磁珠陣列芯片。

芯片的制作流程，見圖2，首先，將光刻膠自旋涂覆在硅片上，并采用光刻工藝進(jìn)行圖形化,。在此基礎(chǔ)上，采用深反應(yīng)離子蝕刻技術(shù)進(jìn)一步形成晶圓內(nèi)的微孔陣列。然后用濃硫酸清洗硅母材。PDMS[預(yù)聚物與交聯(lián)劑的比例為10:1 (w/w)]板坯成型前，母材在真空下連夜暴露于三氯氣(1H、1H、2H、2H-全氟辛基)硅烷(Sigma-Aldrich,USA)蒸汽中，以降低表面能，促進(jìn)PDMS板坯從硅母材中后續(xù)釋放。然后混合物被倒在硅烷主和孵化30分鐘，形成一個結(jié)構(gòu)板。固化后，板被剝離，并穿孔，以創(chuàng)建進(jìn)出口端口，最后通過等離子體處理將PDMS板與玻片牢固粘結(jié)。

圖2 芯片制作流程

為了獲得較為均勻和合適的液滴尺寸，測定了組織溶栓的振動頻率。我們在20s固定的振動時間內(nèi)嘗試不同的頻率，發(fā)現(xiàn)在32Hz以下的乳液具有相對均勻的水滴大小(圖a)。大多數(shù)乳劑的直徑是10至15μm。根據(jù)這個尺寸,我們估計的乳液中混合將包含約2.4×10⁷ -8×10⁷滴。（b）磁珠與液滴的比例很重要。磁珠過多，一個液滴可包裹多個磁珠；磁珠過少的話，會影響回收率。（c）為了評價乳液的質(zhì)量和熱穩(wěn)定性，將乳液滴在玻片上，發(fā)現(xiàn)乳液中液滴的大小和均勻性在熱循環(huán)后沒有發(fā)生變化，這說明了在PCR過程中乳液的熱穩(wěn)定性。

圖3 a) 乳液中液滴的性質(zhì)。(a)不同振動頻率下乳液的特性；(b)一個乳狀液艙內(nèi)的單顆珠子的照片；(c)乳液熱循環(huán)前(左)和熱循環(huán)后(右)的照片。

在破乳過程中，磁珠有一定的損失。珠子的回收率很重要，因?yàn)榛厥章实涂赡軙o結(jié)果帶來較大的檢測誤差，所以我們對乳液破碎過程中磁珠的回收率進(jìn)行了評估(圖a)。在第一次破壞后，珠子被離心，然后用磁鐵收集。將收集到的磁珠懸浮在與基準(zhǔn)體積相同的位置，用分光計進(jìn)行測量，共回收磁珠總量的55%左右。然后將上清液移到另一根試管中，再次重復(fù)破碎和收集的過程，大約有5%的磁珠。第三次，就幾乎沒有。確定了微球的平均回收率為60%。

圖4 磁珠的回收率及其對檢測的影響。(a)磁珠在不同破碎時間的回收率；(b)在回收率為60%的情況下，對不同數(shù)目的tamb進(jìn)行檢測，總體檢測錯誤；(c)在60%的檢測率下，檢測不同數(shù)量的TAMB時的CV值。

圖5 （a）上清液中游離微球和沉淀物中MBCs，研究了不同洗滌次數(shù)后殘留微球的數(shù)量。（b）經(jīng)過1次、2次洗滌后，殘余微球數(shù)量急劇減少，3次洗滌后逐漸減少，說明大部分游離微球已被洗滌3次后清除。確定理想的洗滌時間是4。

圖6 定量檢測目標(biāo)DNA。(a)定量檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度范圍為0.1fm(≈60copies) ~5fm(≈3000copies)；(b)一系列臨床樣本稀釋的定量檢測結(jié)果。右邊的數(shù)字表示每個樣本濃度中計算的MBCs。

點(diǎn)評：

1.本文提出了一種基于微球、乳劑、放大、磁(束)、微球和微柱陣列芯片的核酸定量方法。我們利用鏈霉親和素(SA)改性聚苯乙烯微球捕獲生物素包覆的靶珠，該靶珠可以代表靶DNA的總體。然后將微球-微珠復(fù)合物收集到微柱陣列芯片中，在普通顯微鏡下觀察。由于微球-珠粒配合物的數(shù)量與靶DNA的數(shù)量呈耦合泊松分布關(guān)系，因此通過計算芯片捕獲微球的數(shù)量可以很容易地推斷出靶DNA的數(shù)量。

2.該方法降低了成本，降低了數(shù)字PCR技術(shù)的難度，有望促進(jìn)數(shù)字PCR技術(shù)在科研和臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。

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